DNA测序是确定核苷酸碱基序列的重要分子生物学技术,目前市场上主流的是第二代高通量测序,其基于大规模平行测序技术,能同时完成测序模板互补链的合成和序列数据的获取。IVD是指体外诊断,包括生化诊断,免疫诊断,血球检测,分子诊断,以及POCT。在IVD市场中,测序是分子诊断中一项不可或缺的实验技术。随着以上两种生物技术的发展,测序建库显得尤为重要。建库是指将DNA处理成固定的模式,建库第一步,就是DNA片段化,这对于后续实验来说更为关键。
实验样品:人全血DNA
实验目的:生物DNA样本需要打断到150-300bp进行后续的测序建库实验,为得到这一片段长度下的样本,需进行梯度预实验。
实验设备:
高通量声波基因组剪切仪 JXDNA-500PICO
实验过程:
1.将适配器放入水槽,打开冷水机预冷至4度
2.将稀释好的同一浓度DNA样本按体积梯度投入0.2mL的离心管,标好编号,震荡离心
3.将离心管放入适配器(注意水平配平,尽量将样品放置在适配器外圈)
4.设置好能量,工作时间,间隙时间,循环工作,总时长梯度为17min,20min,25min
5.实验结束后取出样本,进行电泳检测
实验结果:
综上结果可见,样品投入量能影响检测荧光强度,超声打断时间能影响片段长度。综合下机样品的片段长度和荧光强度,以及片段集中性,选择20μL打断25min作为实验条件。
注意事项:
(1)同等条件下人体DNA打断难度大于小鼠大于植物,不同的实验样品需单独进行预实验,不可混用实验结果。
(2)注意离心管内样本体积,确保仪器内水位能完全没过样品。
(3)离心管需要配平,适配器压盖禁止倾斜,避免样本开盖污染。
(4)冷水机需要提前打开预冷,水流循环要调整稳定不能过于激烈
在高通量测序样本制备过程中,DNA片段化处理是一个核心步骤。因此随机、准确、集中无偏差的DNA片段化是保证DNA文库质量和均一性的关键一步。本设备为DNA片段化又提供了新的研究手段,进一步推动了分子生物学的研究发展。
参考文献:
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